Kaj je lahko problem, če se pasovi ne pojavljajo v Western Blot?

Kaj je lahko problem, če se pasovi ne pojavljajo v Western Blot?
Anonim

Odgovor:

Veliko …

Pojasnilo:

Obstaja veliko razlogov, zakaj se pasovi morda ne pojavijo na Western blotu. Ali so kombinacije vzorcev in protiteles delale v preteklosti?

Spodaj so samo nekateri, za katere se lahko spomnim, da lahko povzročijo, da se pasovi ne prikažejo:

  1. Ali je bil protein prenesen iz gela? Poskusite obarvati membrano z nečim, kot je ponceau S ali amido črna, da vidite, ali so pasovi prisotni. Včasih lahko vidite beljakovinske trakove na membrani, tako da jih navlažite in držite pod kotom glede na svetlobo.

  2. Ali primarna protitelesa delujejo? To je težko preizkusiti in edini način, ki ga lahko naredite, je, da vključite pozitivno kontrolo, kjer veste, da imate prisoten zanimiv protein. Če imate nekaj beljakovin, ki vas zanimajo, ga lahko poskusite odkriti na Western blot membrano (tj. Ne poganjate gela) in vidite, če dobite rezultat, če obdelujete membrano, kot da bi bila Western blot.

  3. Ali sekundarno protitelo prepozna primarno protitelo? Spet je težko preizkusiti. O edinem testu, ki ga lahko storite, je točkovni preskus, omenjen zgoraj v točki 2.

  4. Ali deluje "sistem za odkrivanje"? Odvisno od metode odkrivanja, ki jo uporabljate, lahko poskusite napihovati v nekaterih sekundarnih protitelesih, da vidite, ali raztopina za zaznavanje in tudi sprožilno sredstvo / encim na sekundarnem protitelesu deluje. Ali lahko sprožite reakcijo samo s sekundarnimi protitelesi?

Nazadnje, lahko je preprosta kot ena od rešitev, uporabljenih med sondiranjem nepravilno sestavljene parcele. Na primer, če je koncentracija soli v pufru napačna, lahko to povzroči sproščanje protiteles iz blota. Enako bi se zgodilo tudi, če bi bil pH pufrov nepravilen.

"Najčudnejši" vzrok za "Western blot", ki ni deloval, kar sem osebno doživel, je bil, ko smo spremenili dobavitelja mleka v prahu, ki smo ga uporabili za blokiranje membrane. Prašek novega dobavitelja je vseboval fosfotirozin fosfatazo, ki je odstranila vse fosfatne skupine, ki smo jih poskušali zaznati z našim anti-fosfotirozinskim protitelesom.